Repositório Institucional da UFPB
Use este identificador para citar ou linkar para este item:
https://repositorio.ufpb.br/jspui/handle/123456789/23613| Tipo: | TCC |
| Título: | L-asparaginase excretada por Bacillus subtilis sob ação da luz UV |
| Autor(es): | Melquiades, Davi Bezerra |
| Primeiro Orientador: | Silva, Leonor Alves de Oliveira da |
| Primeiro Coorientador: | Nascimento, Sarah Signe do |
| Resumo: | A L-asparaginase (ASNase; EC 3.5.1.1) é uma amidohidrolase responsável por degradar principalmente a L-asparagina, resultando em ácido L-aspártico e amônia. Essa enzima pode ser produzida por diversos seres vivos, mas é estudada principalmente em microrganismos como fungos e bactérias, devido ao seu potencial de produção, dentre eles o Bacillus subtilis, uma bactéria gram-positiva considerada segura e utilizada para produção de proteínas extracelulares. As L-asparaginases mais estudadas em bactérias são das espécies Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi, pois são comercializadas e utilizadas para o tratamento de leucemias, como a LLA e LMA, embora apresentem efeitos colaterais, são utilizadas para degradar o aminoácido que suplementa as células neoplásicas linfoides. Além disso, L-asparaginases fúngicas são utilizadas no pré-tratamento de alimentos ricos em carboidratos que são fritos ou assados reduzindo a formação de acrilamida, um composto neurotóxico com potencial cancerígeno, comercialmente estão disponíveis enzimas produzidas por Aspergillus sp. A L-asparaginase foi produzida em duas condições, com irradiação da luz UV e sem irradiação. Avaliou a atividade enzimática e a quantidade de proteínas solúveis dos extratos brutos e foi realizada cromatografia por troca iônica com o extrato irradiado por luz UV. Posteriormente os perfis proteicos dos extratos brutos e das frações da cromatografia foram avaliados por eletroforese SDS-PAGE. As frações da cromatografia foram avaliados quanto as suas proteínas solúveis, atividade de L-asparaginase, seu potencial antioxidante para o radical DPPH e caracterizada com pH e temperatura ótima e as propriedades cinéticas aparentes da enzima. O extrato não irradiado a luz UV apresentou maior atividade residual de L-asparaginase, porém o extrato irradiado com luz UV apresentou maiores concentrações de proteínas solúveis totais. As frações 2-4 da cromatografia foram selecionadas por apresentarem maiores valores proteicos e atividade residual, assim como potencial inibidor do radical DPPH. A cromatografia fracionou o extrato bruto, observado no gel de SDS-PAGE com rendimento de purificação em 26%. O pH ótimo e temperatura ótima do extrato fracionado foram 8,0 e 50°C respectivamente, com Km de 10,99 mM e Vmax de 0,728 µmol/min para Lasparagina e Km de 13,16 mM e Vmax de 0,566 µmol/min para L-glutamina. Foi observado que a utilização da luz UV aumentou a produção de proteínas totais, porém não promoveu o aumento da atividade enzimática. A partir da cromatografia foi possível fracionar o extrato bruto. A ASNase apresentou atividade antioxidante e afinidade pela asparagina e glutamina. |
| Abstract: | L-asparaginase (ASNase; EC 3.5.1.1) is an amidohydrolase responsible for degrading mainly L-asparagine, resulting in L-aspartic acid and ammonia. This enzyme can be produced by several living beings, but it is studied mainly in microorganisms such as fungi and bacteria, due to its production potential, among them Bacillus subtilis, a gram-positive bacterium considered safe and used for the production of extracellular proteins. The most studied L-asparaginases in bacteria are Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi species, as they are commercialized and used for the treatment of leukemias, such as ALL and AML, although they have side effects, they are used to degrade the amino acid that supplements neoplastic cells lymphoids. In addition, fungal L-asparaginases are used in the pre-treatment of foods rich in carbohydrates that are fried or baked, reducing the formation of acrylamide, a neurotoxic compound with carcinogenic potential, commercially available enzymes produced by Aspergillus sp. L-asparaginase was produced under two conditions, with UV light irradiation and without irradiation. The enzyme activity and the amount of soluble proteins of the crude extracts were evaluated and ion exchange chromatography was performed with the extract irradiated by UV light. Subsequently, the protein profiles of crude extracts and chromatography fractions were evaluated by SDS-PAGE electrophoresis. The chromatography fractions were evaluated for their soluble proteins, L-asparaginase activity, their antioxidant potential for the DPPH radical and characterized with optimal pH and temperature and the apparent kinetic properties of the enzyme. The extract not irradiated with UV light showed higher residual activity of L-asparaginase, but the extract irradiated with UV light showed higher concentrations of total soluble proteins. Chromatography fractions 2-4 were selected for presenting higher protein values and residual activity, as well as DPPH radical inhibitory potential. Chromatography fractionated the crude extract, observed on the SDS-PAGE gel with a purification yield of 26%. The optimal pH and optimal temperature of the fractionated extract were 8.0 and 50°C respectively, with Km of 10.99 mM and Vmax of 0.728 µmol/min for L-asparagine and Km of 13.16 mM and Vmax of 0.566 µmol/min. min for L-glutamine. It was observed that the use of UV light increased the production of total proteins, but did not promote an increase in enzymatic activity. From the chromatography it was possible to fractionate the crude extract. ASNase showed antioxidant activity and affinity for asparagine and glutamine. |
| Palavras-chave: | L-asparaginase Proteínas solúveis Atividade enzimática Cromatografia DPPH |
| CNPq: | CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS |
| Idioma: | por |
| País: | Brasil |
| Editor: | Universidade Federal da Paraíba |
| Sigla da Instituição: | UFPB |
| Departamento: | Ciências Biológicas |
| Tipo de Acesso: | Acesso restrito |
| URI: | https://repositorio.ufpb.br/jspui/handle/123456789/23613 |
| Data do documento: | 27-Jun-2022 |
| Aparece nas coleções: | TCC - Ciências Biológicas |
Arquivos associados a este item:
Não existem arquivos associados a este item.
Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.