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metadata.dc.type: Dissertação
Title: Atividade tocolítica in vitro do extrato etanólico e flavonoides isolados de Zornia brasiliensis Vogel (Leguminosae) em ratas
metadata.dc.creator: Ferreira, Sarah Rebeca Dantas
metadata.dc.contributor.advisor1: Oliveira, Fabiana de Andrade Cavalcante
metadata.dc.description.resumo: Uma vez que o extrato etanólico obtido das partes aéreas de Z. brasiliensis (ZB-EtOHPA) apresentou efeito espasmolítico em diversos músculos lisos, incluindo íleo e traqueia de cobaia, aorta e corpo cavernoso de rato e útero de rata, decidiu-se caracterizar o mecanismo de ação tocolítica in vitro do ZB-EtOHPA em ratas, além de avaliar e comparar um possível efeito tocolítico de flavonoides isolados desta espécie. Após eutanasiadas, o útero era montado em cubas de banhos para órgão isolado onde as contrações isotônicas e isométricas eram monitoradas (n = 5). Sabendo que previamente o ZB-EtOHPA apresentou efeito tocolítico em útero de rata frente às contrações fásicas, decidiu-se investigar seu efeito sobre as contrações tônicas induzidas por ocitocina (OCI) (CE50 = 5,5 ± 1,3 μg/mL). Como uma das principais vias de relaxamento do músculo liso é a via do óxido nítrico (NO), decidiu-se avaliar a participação dessa via no efeito tocolítico do ZB-EtOHPA. Para tanto, utilizou-se L-NAME, um inibidor não seletivo de sintase do NO (NOS) e foi observado que a potência relaxante foi diminuída cerca de seis vezes (CE50 = 35,6 ± 6,2 μg/mL), sendo essa redução parcialmente revertida na presença concomitante de L-NAME (10-4 M) e L-arginina (10-3 ou 3 x 10-3 M), substrato para a NOS (CE50 = 24,8 ± 3,1 μg/mL e 45,4 ± 7,0 μg/mL, respectivamente), confirmando o envolvimento da via do NO no efeito tocolítico do ZB-EtOHPA. Seguindo a via downstream de sinalização intracelular do NO, o próximo passo investigado foi a participação da ciclase de guanilil solúvel (sCG) e da proteína cinase G (PKG). Com isso, observou-se que a potência tocolítica do extrato foi reduzida cerca de 5 e 3 vezes na presença do ODQ, um inibidor da sCG (CE50 = 36,9 ± 7,3 µg/mL) e do Rp-8-Br-PET-cGMPS, um inibidor da PKG (CE50 = 15,4 ± 2,7 µg/mL), respectivamente, confirmando a modulação positiva da via do NO/sCG/PKG no seu efeito tocolítico. Como um dos alvos da PKG são os canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV), propôs-se que o extrato estaria inibindo esses canais. Observou-se que o extrato relaxou o útero pré-contraído com KCl (CE50 = 22,0 ± 1,3 μg/mL), sugerindo uma participação destes canais. Para confirmar essa hipótese, foram realizadas curvas cumulativas ao CaCl2 na ausência e na presença do ZB-EtOHPA, e observou-se um deslocamento dessas curvas controle para direita na presença do extrato com redução do seu efeito máximo. Além disso, o ZB-EtOHPA relaxou o útero pré-contraído com S-(-)-Bay K8644, um agonista dos CaV1, com uma potência cerca de 4 vezes menor (CE50 = 84,3 ± 10,6 μg/mL) em comparação ao efeito observado com KCl, demonstrando que o extrato inibe de forma indireta o influxo de Ca2+ através dos CaV1. Como a PKG também pode modular os canais de K+, investigou-se o efeito do extrato na presença de cloreto de césio, um bloqueador não seletivo de canais de K+ e foi observado um desvio para direita da curva controle do extrato com redução da potência tocolítica (CE50 = 27,1 ± 3,0 μg/mL), o que confirma a participação dos canais de K+ no efeito tocolítico do ZB-EtOHPA. Para verificar qual subtipo de canal de K+ estaria envolvido nesse efeito do extrato, utilizou-se bloqueadores seletivos, e observou-se que a potência tocolítica foi reduzida na presença de tetraetilamônio (CE50 = 16,8 ± 2,8 μg/mL); de apamina (CE50 = 22,0 ± 3,3 μg/mL); de glibenclamida (CE50 = 28,2 ± 5,3 μg/mL) e de 4-aminopiridina (CE50 = 73,2 ± 13,4 μg/mL), bloqueadores de canais de potássio: ativados por cálcio de grande (BKCa) e de pequena condutância (SKCa), sensíveis ao trifosfato de adenosina (KATP) e dependentes de voltagem (KV), respectivamente. Não foi observado efeito sinérgico quando se incubou simultaneamente todos os bloqueadores acima citados. Também foi avaliado o efeito tocolítico de dois flavonoides isolados do ZB-EtOHPA, 7-metoxiflavona (7-MF) e 5,7-dimetoxiflavona (5,7-DMF), e observou-se que ambos apresentaram efeito tocolítico, sendo a 7-MF equipotente frente à OCI (CI50 = 3,2 ± 0,9 x 10-5 M) e ao CCh (CI50 = 4,3 ± 0,4 x 10-5 M) e a 5,7-DMF com potência cerca de 2 vezes maior frente ao CCh (CI50 = 1,7 ± 0,3 x 10-5 M) em relação à OCI (CI50 = 4,2 ± 1,0 x 10-5 M). Dessa forma, o mecanismo de ação tocolítica proposto para o ZB-EtOHPA em rata pode ter envolvimento da modulação positiva na via NO/sGC/PKG e canais de K+, e bloqueio dos Cav1 e, consequentemente, diminuição do influxo de Ca2+, promovendo relaxamento do músculo liso uterino. Além disso, os flavonoides, 7-MF e 5,7-DMF, provavelmente são os responsáveis pelo efeito tocolítico do extrato.
Abstract: Once the ethanolic extract from the Z. brasiliensis aerial parts (ZB-EtOHAP) showed a spasmolytic effect in several smooth muscles, including ileum and trachea of guinea pig, rat aorta and cavernous body, and rat uterus, it was decided to characterize the mechanism of in vitro tocolytic action of ZB-EtOHAP in rats, in addition to evaluating and comparing a possible tocolytic effect of flavonoids isolated from this species. After euthanasia, the uterus was placed in baths for isolated organ where isotonic and isometric contractions were monitored (n = 5). Based on the fact that ZB-EtOHAP previously had a tocolytic effect in rat uterus on phasic contractions, it was decided to investigate its effect on oxytocin-induced tonic contractions (OXY) (EC50 = 5.5 ± 1.3 μg/mL). As the main smooth muscle relaxation pathways is the nitric oxide (NO), we decided to evaluate the participation of this pathway in tocolytic effect of ZB-EtOHAP. L-NAME, a non-selective NO synthase inhibitor (NOS), was used, and it was observed that the relaxing potency was decreased six-fold (EC50 = 35.6 ± 6.2 μg/mL) and partially reversed in the concomitant presence of L-NAME and L-arginine (10-3 e 3 x 10-3 M), substrate to NOS (EC50 = 24.8 ± 3.1 μg/mL; 45,4 ± 7,0 μg/mL, respectively), confirming the involvement NO pathway in the tocolytic effect of ZB-EtOHAP. Following the downstream pathway of intracellular NO signaling, the next step to be investigated was the participation of soluble guanylil cyclase (sCG) and protein kinase G (PKG). Therefore, it was observed that tocolytic potency of extract was reduced about 5 and 3 times in the presence of ODQ, an inhibitor of sCG (EC50 = 36.9 ± 7.3 μg/mL) and Rp-8-Br- PET-cGMPS, a PKG inhibitor (EC50 = 15.4 ± 2.7 μg/mL), respectively, confirming positive modulation of NO/sCG/PKG pathway in tocolytic effect of ZB-EtOHAP. As one of the targets of PKG are voltage-dependent calcium channels (CaV), it was proposed that the extract would be inhibiting these channels. It was observed that extract relaxed the pre-contracted uterus with KCl (EC50 = 22.0 ± 1.3 μg/mL), suggesting a participation of these channels. To confirm this hypothesis, cumulative curves to CaCl2 were performed in the absence and presence of ZB-EtOHAP, and a shift of control curves to the right was observed in the presence of extract with reduction of maximum effect. In addition, ZB-EtOHAP relaxed the pre-contracted uterus with S-(-)-Bay K8644, a CaV1 agonist, with about 4-fold lower potency (EC50 = 84.3 ± 10.6 μg/mL) in comparison to the effect observed with KCl, demonstrating that the extract indirectly inhibits the influx of Ca2+ through CaV1. As PKG can also modulate the K+ channels, we decided to investigate the effect of the extract in the presence of cesium chloride, a non-selective K+ channel blocker and a right shift of the extract control curve was observed (EC50 = 27.1 ± 3.0 μg/mL), confirming the participation of K+ channels in tocolytic effect of ZB-EtOHAP. To check which K+ channel subtype would be involved in this extract effect. selective blockers were used and it was observed that tocolytic potency was reduced in the presence of tetraethylammonium (EC50 = 16.8 ± 2.8 μg/mL), apamine (EC50 = 22.0 ± 3.3 μg/mL), glibenclamide (EC50 = 28.2 ± 5.3 μg/mL) and 4-aminopyridine (EC50 = 73.2 ± 13.4 μg/mL), potassium channel blockers: calciumactivated of large (BKCa) and small conductance (SKCa), ATP-sensitive (KATP) and voltagedependent (KV), respectively. No synergistic effect was observed when all of the abovementioned blockers were incubated simultaneously. It was also evaluated the tocolytic effect of two flavonoids isolated from ZB-EtOHPA, 7- methoxyflavone (7-MF) and 5,7dimethoxyflavone (5,7-DMF), and it was observed that both had a tocolytic effect, being 7-MF equipotent against OCY (IC50 = 3.2 ± 0.9 x 10-5 M) and CCh (IC50 = 4.3 ± 0.4 x 10-5 M) and 5,7DMF with potency about 2 times greater than CCh (IC50 = 1.7 ± 0.3 x 10-5 M) in relation to OCY (IC50 = 4.2 ± 1.0 x 10-5 M). Thus, action mechanism proposed for ZB-EtOHAP in rats may have positive modulation involvement in NO/sGC/PKG pathway and K+ channels, and Cav1 blockade and, consequently, Ca2+ influx decrease, promoting relaxation of smooth muscle uterine. In addition, the flavonoids, 7-MF and 5,7-DMF are probably responsible for tocolytic effect of extract.
Keywords: Espasmolítico
Metoxiflavona
Útero de rata
Óxido nítrico
Canais iônicos spasmolytic
Methoxyflavone
Rat uterus
Nitric oxide
Ionic channels
Extrato etanólico
Efeito tocolítico - Útero de rata
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FARMACOLOGIA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal da Paraíba
metadata.dc.publisher.initials: UFPB
metadata.dc.publisher.department: Farmacologia
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Attribution-NoDerivs 3.0 Brazil
metadata.dc.rights.uri: http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/br/
URI: https://repositorio.ufpb.br/jspui/handle/123456789/13698
Issue Date: 26-Feb-2018
Appears in Collections:Centro de Ciências da Saúde (CCS) - Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos

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